Немският химик Йохан фон Байер е роден в Берлин. У момчето се събужда отрано интерес към химията, а на дванадесет години прави първото си химическо откритие: нова двойна сол - карбонат на медта и натрия. Като завършва гимназия, Байер постъпва през 1853 г. в Берлинския университет, където в продължение на две години се занимава с математика и физика.
След една година служба в армията Байер става студент в Хайделбергския университет и започва да изучава химия под ръководството на Роберт Бунзен, изобретил малко преди това лабораторната горелка, наречена на неговото име. В Хайделберг той съсредоточава вниманието си върху физическата химия. Но след като публикува през 1857 г. статия за хлорметана, се увлича толкова от органичната химия, че започва от следващата година да работи при занимаващия се със структурна химия Фридрих Август Кекуле в лабораторията му в Хайделберг.
Тук Байер изследва органичните съединения на арсена, за което му е присъдена докторска степен. От 1858 г. в продължение на две години работи заедно с Кекуле в Гентския университет в Белгия, а след това се връща в Берлин, където чете лекции по химия в берлинското Висше техническо училище.
Под влияние на увлечението на Кекуле от структурата на органичните съединения, Байер изследва отначало пикочната киселина, а от 1865 г. нататък - структурния състав на индигото, високо ценен в промишлеността син оцветител, наречен на името на растението, от което се получава.
Още през 1841 г. френският химик Огюст Лоран изолира в процеса на изследване на сложния му строеж изатина - разтворимо във вода кристално съединение. Продължавайки опитите, започнати от Лоран, Байер получава през 1866 г. изатин, като използва нова технология за възстановяване на индигото чрез нагряването му с прахообразен цинк. Използваният от него метод позволява да се направи по-задълбочен структурен анализ отколкото при процеса на окисление, осъществен от Лоран.
Анализирайки обратния процес - получаване на индиго чрез окисление на изатин, Байер за пръв път успява да синтезира през 1870 г. индиго, като по този начин прави възможно промишленото му производство. След като заминава през 1872 г. за Страсбург и заема мястото на професор по химия в Страсбургския университет, той пристъпва към изучаване на кондензацията, процес, при който се отделя вода. Кондензирайки групи съединения като алдехидите и фенолите, той и колегите му успяват да изолират няколко имащи важно значение багрилни вещества, по-специално пигментите на зозина, които по-късно Байер синтезира.
През 1875 г., след смъртта на известния химик-органик Юстус фон Либих, Байер става негов наследник, заемайки длъжността професор по химия в Мюнхенския университет.
Като се връща към изучаването на точната химическа структура на индигото, Байер обявява през 1883 г. резултатите от изследванията си. Индигото според него се състои от две свързани "осеви" молекули (които нарича индол). В продължение на четиридесет години създаденият от Байер модел остава непроменен. Преразгледан е едва след появата на по-съвършени технологии.
Изучаването на оцветителите довежда Байер до изследването на бензола, в чиято молекула шестте въглеродни атоми образуват пръстен. За природата на връзката между въглеродните атоми в молекулярния пръстен съществуват много съперничещи си теории. Байер, който по душа е преди всичко химик-експериментатор отколкото теоретик, не приема нито една от тях, а предлага своя - теорията за "напрежението". В нея ученият твърди, че заради наличието на други атоми в молекулата, връзките между атомите на въглерода се намират под напрежение и това напрежение определя не само формата на молекулата, но и нейната стабилност. И макар че тази теория е получила днес малко по-съвременна трактовка, същността й, схваната вярно от Байер, остава непроменена. Изследването на бензола го довежда също до разбирането, че структурата на молекулата на бензолната група на ароматните съединения, наречени хидроароматни, е нещо средно между пръстеновидно образувание и структура на молекула на безпръстенен въглеводород. Това негово откритие не само сочи взаимната връзка между дадените три типа молекули, но и дава нови възможности за тяхното изследване.
През 1885 г., когато става на петдесет години, Байер е удостоен заради заслугите си с наследствена титла, която му дава право да постави през фамилното си име частицата "фон".
През 1905 година той получава Нобелова награда за химия. Продължава да изследва молекулярните структури. Работата му с кислородните съединения го довеждат до открития, свързани с четиривалентността и основността на кислорода. Занимава се и с изучаване на връзката между молекулярната структура и оптичните свойства на веществата, по-специално цвета им.
До излизането си в пенсия Байер продължава да се занимава ентусиазирано с изследователска дейност. Уважават го много за изкуството му на експериментатор и изследователския му ум. Въпреки че получава много изгодни предложения от химически фирми, той отказва да се занимава с промишлено прилагане на откритията си и не получава никакви доходи от работата си.
Сред наградите, получени от Байер, са медалът Дейви, присъден му от Лондонското кралско дружество. Член е на Берлинската академия на науките и Немското химическо дружество.